Guía de trabajo práctico para estudiantes de segundo año de la carrera de medicina (página 2)

• 17. No abandonar el laboratorio sin la debida
  autorización del profesor.

• 18. El incumplimiento de alguno de los aspectos
  relacionados, se considera una indisciplina.

Práctica de
Laboratorio No. 1

Tema 2: Parasitología
Médica

Título: Diagnóstico de laboratorio de
protozoos
intestinales y sanguíneos.

Objetivos:

• Enumerar los diferentes productos patológicos
  que se requieren para el diagnóstico de los protozoos
  intestinales y sanguíneos.

• Mencionar las características que deben
  cumplir las diferentes muestras para el diagnóstico de
  protozoos intestinales y sanguíneos, así como
  los métodos diagnósticos empleados en cada
  caso.

• Observar al microscopio quistes de protozoos
  intestinales y formas parasitarias de
  Plasmodium.

Aspectos teóricos

Las enfermedades asociadas a
protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en la
población mundial algunas de ellas
acompañadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso
del paludismo y la
tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos
intestinales como Giardia lamblia y Entamoeba
histolytica son causa de mal nutrición,
pérdida de peso y diarreas
severas; otros, como Plasmodium sp, Trypanosoma sp y
Leishmania producen afecciones cardíacas y del SNC,
dañan las membranas mucosas, la piel y
diferentes órganos de la economía.

Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y
complejos. El
conocimiento de éstos permite realizar una toma de la
muestra en el
momento adecuado con el fin de poder observar
el agente biológico y con ello realizar el
diagnóstico certero de la enfermedad. Demostrar e
identificar el agente infectante se considera la regla de
oro en el
diagnóstico parasitológico.

Diagnóstico de los protozoos
sanguíneos.

Dentro de los protozoos sanguíneos se destacan
por su incidencia e importancia epidemiológica
Plasmodium sp, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei y
Leishmania donovanii.

• a) Toma de la muestra: Es necesario tener en
  cuenta el período en el cual el parásito de
  acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre
  (parasitemia) o se encuentra presente en determinados
  órganos y/o tejidos (sitios de inoculación) en
  los que produce lesiones características. Atendiendo a
  ello las muestras pueden ser:

• Sangre periférica

• Tejidos

• LCR

• Exudado de las lesiones

• Aspirado del chancro inicial o del ganglio
  linfático

b) Métodos de
diagnóstico: Pueden ser indirectos o directos. Los
primeros se basan en la determinación de la respuesta
inmune del organismo ante la infección parasitaria a
través de pruebas
inmunoserológicas y los directos se sustentan en la
observación de las formas parasitarias. Los
métodos directos son los más empleados. Estos
pueden ser:

• Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de
  sangre entre cubre y portaobjetos y se observa al microscopio
  con objetivo seco de 40x.

• Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre
  sobre un portaobjeto, se seca al aire y se fija con metanol.
  Teñimos por el método de Giemsa y observamos al
  microscopio con objetivo de inmersión
  (100x).

• Gota gruesa: se extiende una gota de sangre en un
  área del portaobjeto de 1cm2, se deja secar, se
  tiñe por el método de Giemsa y se observa al
  microscopio con objetivo de inmersión
  (100x).

Los métodos indirectos más utilizados son:
ELISA, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitación,
Fijación del complemento y Aglutinación.

Diagnóstico de protozoos intestinales:

Dentro de los protozoos intestinales se destacan por su
interés
clínico Entamoeba histolytica y Giardia
lamblia.

• a) Toma de la muestra: La muestra ideal son las
  heces las que deben ser colectadas preferiblemente en un
  recipiente de cristal o plástico correctamente lavado
  y seco. Deben ser además frescas (recién
  emitidas) y procesadas rápidamente en particular
  cuando queremos observar los trofozoítos de estos
  parásitos. De no ser posible el procesamiento
  inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden
  ser: refrigeración a 4oC, en formol al 5 ó 10
  %, alcohol polivinílico (PVA) ó en una
  solución de Mertiolato-yodo-formol (MIF). La muestra
  debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocado
  en el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las
  sustancias aquí presentes pueden dañar los
  trofozoítos. En los parasitismos es común que
  no se excreten constantemente las formas parasitarias, este
  fenómeno está estrechamente relacionado con el
  ciclo de vida del parásito y se conoce como fase de
  excreción negativa, por tal motivo se recomienda
  siempre indicar de tres a seis exámenes de heces con
  un periodo de dos a tres días entre uno y otro
  (exámenes seriados). En los casos de alta sospecha
  clínica de giardiosis se puede obtener también
  una muestra de aspirado duodenal o de biopsia duodenal para
  realizar el diagnóstico, siempre que los
  análisis de las heces hayan resultado
  negativos.

• b) Métodos de
  diagnóstico:

• Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca
  una pequeña porción de las heces en un
  portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o
  solución salina fisiológica, se coloca sobre la
  preparación una lámina cubreobjeto y se examina
  al microscopio con objetivo de 40x.

• Métodos de concentración: Aumentan
  considerablemente la sensibilidad del diagnóstico.
  Utiliza una mayor cantidad de muestra (1 gramo
  aproximadamente) y se basan en la diferencia que pueda
  existir entre el peso específico de la sustancia en la
  cual se disuelve la muestra y las formas parasitarias. Basado
  en ello se han diseñado diferentes métodos,
  dentro de ellos el de Ritchie (solución
  formol-éter/acetato de etilo) es el más
  utilizado para el diagnóstico de los protozoos y por
  el cual se obtiene un concentrado de los quistes por un
  proceso de sedimentación.

• Métodos indirectos: Los más utilizados
  son ELISA y aglutinación.

Problema: Usted tendrá en su puesto de
trabajo un
extendido de sangre
teñido con Giemsa con formas parasitarias de Plasmodium
sp., así como diferentes muestras de heces conservadas en
formol que contienen quistes de protozoarios. Realizará el
montaje para el exámen directo de las heces y
observará al microscopio las
diferentes formas parasitarias.

Reactivos y Materiales

• Frotis de sangre periférica teñido con
  Giemsa.

• Láminas portaobjetos y
  cubreobjetos

• Microscopio óptico

• Muestras de heces conservadas en formol

• Aplicadores

• Guantes

• Lugol

Procedimiento

Para el exámen de las heces: (Guarde las medidas
adecuadas de bioseguridad, colóquese los guantes antes de
proceder)

• a) Coloque en la lámina portaobjeto una
  gota de reactivo de lugol.

• b) Con un aplicador tome una pequeña
  porción de heces y mezclela con la gota de lugol en el
  portaobjetos haciendo un pequeño círculo.
  (Utilice una lámina para cada muestra)

• c) Coloque encima una lámina
  cubreobjetos.

• d) Lleve la lámina al microscopio
  óptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr una
  imagen nítida, pase al objetivo de 40x.

• e) Observe detenidamente las
  características de los quistes observados y realice en
  su cuaderno un esquema de las diferentes formas
  parasitarias.

Para observar la lámina de sangre
periférica:

• a) Adicione sobre la preparación una
  gota de aceite de cedro.

• b) Enfoque con objetivo de inmersión
  100x

• c) Realice en su cuaderno un esquema de las
  características de las formas de Plasmodium
  observadas.

Presentación de los resultados

– Realice un informe escrito
de lo observado en cada una de las preparaciones.

Autopreparación

Consulte en su libro de
texto,
Microbiología y Parasitología
Médica Tomo III, los siguientes
capítulos:

• Capítulo 76, Generalidades, los tema: Ciclo
  evolutivo, Proceso infeccioso parasitario, Fuentes de
  infección, Vías de entrada al hospedero y
  Diagnóstico clínico y de laboratorio de las
  enfermedades parasitarias (páginas 9, 11,12, 16 y
  17)

• Capítulo 78, Giardia lamblia
  (páginas 31-35)

• Capítulo 84, Ameba (páginas
  107-109)

• Capítulo 88, Plasmodium
  (páginas 151-153 y 159-160)

Después proceda a responder las siguientes
preguntas:

• 1. ¿Cuáles son las formas
  infectantes de Giardia lamblia y Entamoeba
  histolytica y cuáles son sus
  características más sobresalientes?

• 2. ¿Qué requisitos deben cumplir
  las muestras de heces para estudio parasitológico y en
  particular para la búsqueda de protozoos intestinales?
  ¿Qué otra muestra puede ser útil para el
  diagnóstico de la giardiosis?

• 3. Ante un paciente con sospecha clínica
  de paludismo, ¿Qué examen usted
  indicaría? ¿qué muestra sería
  necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este
  parásito, ¿qué formas parasitarias
  pudiera encontrar en dicha muestra?

• 4. En un paciente con un cuadro de diarrea
  aguda en el que sospecha una amebiasis, resultó
  negativo el primer examen de las heces. ¿Considera
  usted este resultado concluyente? Fundamente su
  respuesta.

Práctica de
Laboratorio No: 2

Tema 2: Parasitología
Médica

Título: Diagnóstico de helmintos
intestinales

Objetivos:

• Mencionar los requisitos que debe cumplir la muestra
  de heces para el diagnóstico de infecciones por
  helmintos intestinales y los métodos de
  diagnóstico más frecuentemente
  empleados.

• Observar al microscopio huevos y larvas de
  helmintos.

• Observar las características
  macroscópicas de formas adultas de
  helmintos.

Aspectos teóricos.

Las helmintiasis afectan a una gran parte de la
población mundial, en particular a aquellas personas que
no guardan las condiciones higiénico sanitarias adecuadas;
la defecación al aire libre, la
ingestión de agua no
potable para el consumo y de
alimentos
contaminados con tierra, el no
lavado o el lavado incorrecto de las manos antes de ingerir
alimentos, entre otras, constituyen muchas de las causas por las
cuales las personas se infectan con estos
parásitos.

Tal y como ocurre con los protozoos, los helmintos
también poseen ciclos de vida variados y complejos y su
conocimiento
es importante toda vez que permite establecer las pautas tanto
para el diagnóstico de laboratorio como para la
prevención de estas enfermedades.

En los helmintos podemos observar tres formas
parasitarias diferentes: el adulto, el huevo y la larva. Los
helmintos adultos, de forma general, tienen una talla que permite
ser observados a simple vista, sin embargo los huevos y las
larvas son microscópicas. Por tal motivo, el
diagnóstico de laboratorio en estos casos se basa tanto en
la observación macroscópica de las muestras
buscando las formas adultas del parásito, como en la
observación microscópica en la búsqueda de
huevos y larvas.

Diagnóstico de laboratorio

• a) Toma de la muestra: La muestra generalmente
  son las heces y los requisitos para su obtención y
  conservación son los mismos que para el
  diagnóstico de los protozoarios. A diferencias de las
  infecciones por protozoarios, en estos parasitismos la
  diarrea no es un síntoma clínico común
  por lo que a veces a determinados pacientes se les hace
  difícil obtener la muestra. Es importante en estos
  casos aclarar que la muestra siempre debe ser obtenida por
  defecación espontánea ya que la
  utilización de laxantes y/o lavados intestinales
  incrementa el volumen de líquido y con ello la
  dilución de las formas parasitarias que puedan estar
  presentes en ella. Para el diagnóstico
  específico de Fasciola hepática,
  Ancylostoma duodenalis, Necator americanus y Strongyloides
  stercoralis la muestra de aspirado duodenal
  también puede ser útil en la búsqueda de
  huevos del parásito cuando los seriados de heces son
  negativos.

• b) Métodos de diagnóstico: Al
  igual que para protozoos los métodos pueden ser
  directos e indirectos, siendo los directos los más
  recomendados.

• Exámen directo entre cubre y portaobjeto: se
  coloca una pequeña porción de las heces en un
  portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o
  solución salina fisiológica, se coloca sobre la
  preparación una lámina cubreobjeto y se examina
  al microscopio con objetivo de 40x buscando huevos y
  larvas.

• Métodos de concentración:

• Método de Ritchie (ver clase práctica
  1)

• La Copa Cónica: está basado en la
  sedimentación y es el más utilizado para el
  diagnóstico de Fasciola dado el gran
  tamaño y peso de estos huevos.

• Método de Faust: es una técnica basada
  en la flotación que emplea sulfato de zinc.

• Método de Sheather: es un método
  común basado en la flotación que emplea una
  solución sobresaturada de azúcar, sal y
  formol.

• Tamizaje de la heces: Consiste en hacer pasar las
  heces por un tamiz (colador) para observar parásitos
  adultos o fragmentos de ellos. Auxiliados con una lupa
  podemos identificar el agente por sus características
  macroscópicas.

• Método de Graham o de la cinta adhesiva: Es
  un método especial para la identificación de
  huevos de Enterobius vermicularis, (también
  puede ser útil en el diagnóstico de Taenia
  sp). Consiste en aplicar un fragmento de cinta adhesiva
  transparente en la zona perianal del paciente, se retira y
  luego se coloca sobre una lámina portaobjeto para
  observar al microscopio los huevos
  característicos.

• Método de Harada-Mori: Es una técnica
  empleada para el cultivo de larvas de nemátodos de
  interés clínico. Es un método
  útil para la diferenciación de ancylostomideos
  cuyos huevos son idénticos y es indispensable para el
  diagnóstico y seguimiento de las infecciones por
  Strongyloides stercoralis.

• Método de la tinta china: Permite la
  diferenciación de las especies de Taenia a
  través del conteo de las ramas uterinas de los
  proglótides.

Problema: Usted encontrará en su
puesto de trabajo diferentes vidrios reloj que contienen formas
adultas de helmintos para la observación y descripción de sus características
macroscópicas. Asimismo encontrará diferentes
muestras de heces conservadas en formol las que contienen huevos
y larvas de parásitos, procederá al montaje de las
heces por examen directo y la observación posterior al
microscopio.

Reactivos y materiales:

• Guantes

• Láminas portaobjetos

• Láminas cubreobjetos

• Aplicadores

• Reactivo de Lugol.

• Vidrios reloj con parásitos
  adultos.

• Muestras de heces conservadas en formol

Procedimiento:

– Exámen directo de las heces:

• a) Proceda de la misma forma que en la
  práctica anterior (Diagnóstico de protozoos
  intestinales) Recuerde guardar las medidas de bioseguridad
  requeridas, colóquese los guantes antes de comenzar a
  trabajar.

• b) Observe detenidamente las
  características de los huevos y larvas. Realice un
  esquema de lo observado en su cuaderno relacionando cada uno
  de ellos con el parásito correspondiente

– Parásitos adultos:

• a) Observe detenidamente los parásitos
  adultos contenidos en cada vidrio reloj y detalle cada una de
  sus características.

• b) Realice las siguientes anotaciones en su
  cuaderno de trabajo: clasificación (si es Nematelminto
  o Platelminto y en este último caso si es Cestode o
  Trematodo), tamaño aproximado, diferencias entre
  hembra y macho, otras características
  distintivas.

Presentación de los resultados:

Confeccione un informe que recoja las observaciones
macroscópicas y microscópicas
realizadas.

Autopreparación:

Consulte en su libro de texto, Microbiología y
Parasitología Médica Tomo III, los Capítulos
siguientes:

• Capítulo 95, Ascaris, (página
  211-214)

• Capítulo 96 Trichuris (página
  217-219)

• Capítulo 97 Acylostomas y Necator
  (páginas 221-224)

• Capítulo 98 Strongyloides
  (página 229-231)

• Capítulo 100 Enterobius
  (páginas 243-245)

• Capítulo 112 Taenia saginata y Taenia
  solium (páginas 331-335

• Capítulo 121 Fasciola (página
  381-383 y 385)

Proceda luego a responder las siguientes
preguntas:

• 1. Plantee las diferencias morfológicas
  fundamentales entre nematodos, cestodes y
  trematodos

• 2. ¿Cuál es el nematodo
  intestinal de mayor tamaño? ¿Cómo usted
  reconocería a simple vista la hembra de este
  parásito? ¿Qué características
  distintivas tienen sus huevos?

• 3. ¿Qué diferencias presentan las
  formas adultas de la hembra y el macho de Trichuris
  trichiura que permiten su reconocimiento?
  ¿Qué características tienen sus
  huevos?

• 4. ¿Para qué se utiliza el
  método de Graham?

• 5.  ¿Qué características
  poseen los huevos de Enterobius
  vermicularis?

• 6. ¿Por que es necesario la
  tinción con tinta china de los proglótides,
  para la diferenciación entre T. solium y
  T. saginata?

• 7. En un paciente infectado por Fasciola
  hepática ¿qué forma parasitaria
  usted espera encontrar en las heces?, ¿qué
  características fundamentales poseen los huevos de
  este parásito?

Práctica de
laboratorio 3

Tema 3: Bacteriología
médica

Microscopía y coloraciones. Cultivo de los
microorganismos.

Objetivos:

• Realizar tinción de preparaciones por los
  métodos de Gram y Ziehl Neelsen.

• Identificar al microscopio diferentes
  morfologías bacterianas y sus características
  tintoriales.

• Observar las características del crecimiento
  bacteriano en diferentes medios de cultivo

Aspectos teóricos

Durante el transcurso de una investigación bacteriológica la
definición de la morfología
y las características tintoriales de un microorganismo
constituyen elementos claves para su identificación y el
punto de partida para la realización posterior de pruebas
fisiológicas y bioquímicas indispensables para la
clasificación definitiva en género y
especie.

El trabajo con microorganismos en el laboratorio se
realiza en condiciones asépticas, tanto para evitar
la
contaminación de la muestra con los microorganismos
ambientales como del investigador con la muestra. Es por esto que
es necesario trabajar siempre en el entorno de la llama de un
mechero bunzen, en un cuarto climatizado (cuarto de siembra) y en
determinadas actividades bajo la protección de un gabinete
de seguridad o flujo
laminar.

Definición de las características
morfológicas y tintoriales: Para definir las
características morfológicas y tintoriales de una
bacteria presente en una muestra lo primero es la
preparación del frotis y la tinción posterior con
colorantes apropiados.

Una de las técnicas
de tinción más empleadas en Bacteriología es
la Tinción de Gram. Este método,
descrito por Christiam Gram en el año 1884, permite
dividir a las bacterias en
dos grandes grupos
(grampositivas y gramnegativas). Utiliza dos colorantes
básicos (violeta cristal y safranina) una solución
mordiente encargada de fijar el colorante violeta (lugol) y una
solución decolorante (alcohol al
70%). Las bacterias Gram positivas retienen el colorante violeta
cristal, por lo que se observan teñidas de color violeta,
mientras que las gramnegativas se decoloran por la acción
del alcohol y toman el segundo colorante (safranina) por lo que
se ven de color rosado.

El fundamento de este método, se consideró
hasta hace pocos años, estaba basado en la diferencia en
la composición química de la pared
celular de ambos grupos bacterianos, sin embargo, estudios
más recientes han demostrado la participación de
proteínas citoplasmáticas en esta
respuesta.

Algunas bacterias no son capaces de teñirse por
el método de Gram, para estos casos se utilizan
métodos de tinción especiales. Uno de los
más utilizados es el de Ziehl Neelsen para la
identificación de micobacterias. Esta es una
tinción diferencial que utiliza la fucsina fenicada como
primer colorante, alcohol ácido como solución
decolorante y el azul de metileno como colorante de contraste.
Los géneros Mycobacterium, Nocardia y algunos
actinomicetos resisten la decoloración por el alcohol
ácido y permanecen teñidos con el primer colorante
(rojo). Es por esto que se conocen como bacilos ácido
alcohol resistente (BAAR). El principio de este método se
basa en la alta proporción de ácidos
micólicos (lípidos)
presentes en la pared celular de estos microorganismos que los
hace resistentes a la decoloración una vez teñidos
por la fucsina. El resto de las bacterias sí se decoloran
y se tiñen con el segundo colorante observándose de
color azul.

Cultivo de los microorganismos: Los medios de
cultivo son soluciones
acuosas de diferentes sustancias nutritivas, necesarias para el
crecimiento y la reproducción de los microorganismos. Estos
son clasificados:

• Según su estado físico en:
  líquidos, sólidos o semisólidos. La
  solidez de los medios se consigue por la adición de
  agar. El agar es una sustancia inerte, es decir, no es un
  nutriente ni tampoco interfiere con otros constituyentes del
  medio de cultivo.

• Según su finalidad los medios se clasifican
  en:

• Generales o universales: Garantizan el crecimiento
  de un elevado número de microorganismos. Ej. Agar
  nutriente, Agar sangre, Caldo cerebro–corazón,
  etc.

• Enriquecimiento: Son medios complejos con aditivos
  adicionales para favorecer el crecimiento de determinados
  microorganismos (particularmente exigentes). Ej. Caldo
  selenito, Caldo tetrationato de sodio, etc.

• Selectivo: Son aquellos que favorecen por su
  diseño el crecimiento específico de un
  microorganismo (o grupo de microorganismos). Es de gran
  utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de
  una población microbiana mixta. Ej. Agar SS, Agar Mc
  Conkey, Agar TCBS

• Diferencial: Destinados a facilitar la
  discriminación de microorganismos de una mezcla por
  sus propiedades diferenciales del crecimiento en dichos
  medios.

Instrumentos de siembra: Los instrumentos empleados
son:

• Asa de alambre

• Aguja de alambre

• Hisopo

• Pipeta

• Espátula de Drigalsky

• Jeringuilla

Métodos de siembra: La siembra de acuerdo a los
propósitos, el instrumento utilizado y las
características del medio donde se va a realizar el
cultivo puede realizarse por:

• Diseminación: se realiza de diferentes formas
  y con instrumentos variados dependiendo del objetivo que se
  persiga. Ejemplo: para obtener colonias aisladas en un medio
  de cultivo sólido se utiliza la diseminación
  por estrías, para lo que se emplea el asa de alambre.
  (Fig. 3.1)

• Picadura: se realiza con aguja de alambre,
  fundamentalmente en medios sólidos o semisólidos
  contenidos en tubos de cultivo.

• 

• A profundidad: También conocido como placa
  vertida. Es un método de siembra especial donde por lo
  regular el inóculo se mezcla con el medio de cultivo.
  (Fig. 3.2)

Incubación: Los medios de cultivo sembrados se
colocan en incubadoras a la temperatura,
humedad y concentración de oxígeno
óptimas para el crecimiento. Las condiciones de
incubación dependen de las características y del
tiempo de
generación del microorganismo. Las bacterias que
comúnmente parasitan al hombre se
desarrollan bien a temperaturas entre 35 y 37 oC en
períodos de 18 a 24 horas.

Observación del crecimiento: Después de la
incubación se observan las características del
crecimiento del microorganismo y los cambios ocurridos en el
medio de cultivo. En medios de cultivo en placas Petri pueden ser
apreciados los caracteres de las colonias microbianas: color,
borde (entero o festonado) brillo, superficie (lisa o rugosa)
tamaño y producción de lisis de los glóbulos
(éste último solo si el medio de cultivo empleado
fuera Agar Sangre).

Problema: usted encontrará en su
puesto de trabajo placas con cultivo bacteriano los que
deberán identificar morfológicamente por la
técnica de Gram definiendo forma, modo de
agrupación y carácter tintorial del microorganismo,
describirá además las características
más sobresalientes observadas en los cultivos.
Encontrará frotis elaborados a partir de una muestra de
esputo para realizar tinción de Ziehl
Neelsen.

Reactivos y materiales.

• Asa de siembra

• Portaobjetos

• Colorantes para la tinción de Gram

• Colorantes para la tinción de Ziehl
  Neelsen

• Preparaciones para teñir por Ziehl
  Neelsen

• Mechero bunzen

• Aceite de cedro

• Agua destilada estéril

• Placas y tubos con cultivos.

Procedimiento.

Preparación del frotis a partir del
cultivo:

1. Coloque sobre la lámina portaobjeto una gota
de agua destilada estéril.

2. Esterilice el asa de siembra a la llama del mechero.
(Fig. 3.3)

3. Arrastre una pequeña porción del
cultivo bacteriano con el asa en condiciones
asépticas.

4. Suspenda las células en
la gota de agua sobre el portaobjeto.

5. Deje secar al aire.

6. Fije la preparación cortando con la
lámina tres veces la llama del mechero (Fig.
3.4).

Tinción de Gram

• Cubra el frotis con cristal violeta al 1%, espere 30
  segundos y lave con agua corriente.

• Cubra el frotis con lugol, espere 30 segundos y lave
  con agua corriente.

• Cubra el frotis con alcohol etílico o alcohol
  acetona, espere 30 segundos y lave con agua
  corriente

• Cubra el frotis con el colorante safranina, espere
  30 segundos y lave con agua corriente.

• Secar al aire.

• Adicione una gota de aceite de cedro sobre la
  preparación y observe al microscopio con el objetivo
  de mayor aumento (100X).

• Realice un esquema en su cuaderno de lo observado y
  anote las características morfológicas y
  tintoriales del microorganismo problema.

Tinción de Ziehl Neelsen

• Cubra el frotis con fucsina y caliente el colorante
  sobre la lámina dándole calor a la
  lámina por debajo hasta que se observe la
  emisión de vapores. Espere 5 minutos y lave con
  abundante agua corriente.

• Cubra la lámina con alcohol-ácido,
  espere 2 minutos y lave con agua corriente.

• Cubra la preparación con azul de metileno,
  espere 30 segundos y lave con agua corriente.

• Secar al aire.

• Coloque sobre la preparación una gota de
  aceite de cedro y observe al microscopio con objetivo de
  inmersión (100X).

• Anote en su cuaderno los resultados de la
  observación.

Definición de características
culturales

• Observe detenidamente los cultivos en las placas y
  determine las diferentes características de las
  colonias: tamaño, color, borde, superficie, aspecto,
  producción de hemólisis, etc.

• Anote los resultados de lo observado en su cuaderno
  de trabajo

Presentación de los resultados:

Prepare un informe con los resultados obtenidos del
trabajo realizado en el laboratorio de acuerdo a las indicaciones
de su profesor.

Autopreparación

Revise en su libro de texto, Microbiología y
Parasitología Médica Tomo I, los capítulos
que a continuación se relacionan:

• Capítulo 4, Microscopía y coloraciones
  (Pág. 20-28)

• Capítulo 5, Características de las
  células procarióticas y eucarióticas
  (Pág. 29-36)

• Capítulo 7 Cultivo y crecimiento de los
  microorganismos (Pág. 45-54)

Proceda después a responder las siguientes
preguntas:

• 1. La coloración de Gram es una de las
  más utilizadas en Bacteriología, ¿en
  qué se fundamenta este método?

• 2. La tinción de Ziehl Neelsen se
  utiliza para la observación al microscopio de las
  micobacterias. ¿Cuál es el fundamento de este
  método de tinción?, ¿considera usted que
  si se omitiera el paso del calentamiento de la fucsina sobre
  la lámina, se obtendrían los mismos resultados?
  Fundamente.

• 3. ¿Qué se conoce como cultivo o
  siembra en Bacteriología? Cite ejemplos de medios de
  cultivo generales, diferenciales, selectivos y de
  enriquecimiento.

• 4. El agar es una sustancia inerte que aporta
  solidez a los medios de cultivo permitiendo el desarrollo de
  colonias aisladas. ¿Qué ventajas representa
  esto para el diagnóstico?

• 5. La tinción negativa es uno de los
  métodos empleados en el laboratorio de
  microbiología. Al respecto diga: ¿qué
  tipo de colorantes usted utilizaría en este caso?,
  ¿qué diferencias tiene este método con
  un método de tinción simple?

Clase práctica
No 4

Tema III Bacteriología
Médica

Título: Quimioterapia antimicrobiana.
Métodos de respaldo al tratamiento
antimicrobiano.

Objetivos:

• Interpretar los mecanismos de acción de las
  drogas antimicrobianas y los mecanismos de resistencia
  desarrollados por las bacterias para contrarrestar su
  efecto.

• Interpretar los resultados de un antibiograma por
  métodos de difusión y dilución de
  acuerdo a las categorías de susceptibilidad
  establecidas.

Aspectos teóricos

El descubrimiento de los antibióticos en el
pasado siglo dio inicio a una nueva era en el tratamiento de las
enfermedades infecciosas que estuvo marcada en la década
de los años 20 por la obtención de la penicilina a
cargo del notable científico Sir Alexander Fleming. La
introducción de este antibiótico por
primera vez en la clínica a inicios de la década
del 40 y los subsiguientes descubrimientos de otras drogas con
mecanismos y espectro de acción variados, permitió
ganar una de las más importantes batallas libradas por
el hombre en
la lucha por la supervivencia.

Prácticamente desde los inicios en el uso de las
entonces consideradas "drogas milagrosas" se evidenció la
capacidad que tenían los microorganismos tanto para
desarrollar mecanismos capaces de contrarrestar el efecto de
estos fármacos, como de trasmitir tal
característica a otros miembros de su progenie. Los
mecanismos de resistencia
desarrollados por las bacterias están estrechamente
relacionados con el "blanco"o estructura de
la
célula sobre la que actúa un antibiótico
o grupos de antibióticos en específico.

En la actualidad existen en uso más de un
centenar de drogas pertenecientes a diferentes grupos y
generaciones de antimicrobianos con capacidad variada para
inhibir y matar microorganismos. Los mecanismos de acción
de estos fármacos se agrupan generalmente en los
siguientes:

• 1) Los que inhiben la síntesis de la
  pared celular

• 2) Los que inhiben la función de la
  membrana celular

• 3) Los que inhiben la síntesis
  proteica

• 4) Los que inhiben la síntesis de los
  ácidos nucleicos

Inhibición de la síntesis
de la pared celular: Los antibióticos que actúan
afectando la pared celular, tienen la capacidad de unirse a
proteínas de la membrana citoplasmática bacteriana
conocidas como PBP, siglas provenientes del inglés
"penicilin binding protein" o lo que es lo mismo,
proteínas de unión a penicilina. Estas, en su
mayoría transpeptidasas, son las encargadas de transportar
las pequeñas cadenas peptídicas que junto a las
subunidades repetidas de N-acetilglucosamina y
N-acetilmurámico conforman la estructura de enrejado
característico del peptidoglucano, sustancia que aporta
rigidez a la pared de la bacteria y que le permite garantizar su
forma e integridad celular. La unión de la penicilina a
esta enzima por su centro activo, impedirá a la
transpeptidasa cumplir su función;
como consecuencia se debilita la pared y la bacteria muere por
lisis celular. Ejemplos de antibióticos que actúan
por esta vía son todos los pertenecientes al grupo de los
ÃY-lactámicos (antibióticos que se
caracterizan por presentar en su estructura química un
anillo ÃY-lactámico) que son los más
abundantes y utilizados en la clínica. Entre los
más conocidos podemos citar las penicilinas y todos sus
derivados, además de otros como el ceporán,
cefazolina y ceftriaxone, representantes de las
cefalosporinas.

Inhibición de la función de la membrana
celular: Los antibióticos que actúan a este nivel
realizan función de detergentes o surfactantes, estos
compuestos se adosan a la superficie externa de la membrana
celular alterando su estructura y propiedades osmóticas.
La unión de estos compuestos a la membrana se cree
producen una reorientación de la estructura de mosaico
fluido característico. Actúan por esta vía
las polimixinas y los antifúngicos,
fundamentalmente.

Inhibición de la síntesis proteica: Los
fármacos que actúan impidiendo esta función
tienen la capacidad de interactuar con el ribosoma bacteriano de
forma selectiva en alguno de los eventos que
ocurren a nivel de las subunidades 30S y/o 50S, interfiriendo de
algún modo en la fidelidad de la lectura del
código
genético o por interferencia directa en alguno de los
procesos de la
síntesis proteica propiamente dicha. Una variedad de
antibióticos actúan de esta forma entre los que se
encuentran el cloramfenicol, la eritromicina, tetraciclina,
kanamicina y gentamicina, entre otros.

Inhibición de la síntesis de los
ácidos nucleicos: Por este mecanismo los
antibióticos actúan alterando la estructura
organizada de doble hélice del ADN bacteriano
por bloqueo de la enzima ADN gyrasa o Topoisomerasa II
afectándose el proceso de
replicación y posteriores eventos de transcripción
y traducción para la síntesis
proteica. Ejemplos de antibióticos que actúan a
este nivel son las quinolonas representadas por el ácido
nalidíxico y la ciprofloxacina, entre otros así
como también la rifampicina.

Mecanismos de resistencia de las bacterias a los agentes
antimicrobianos.

Se plantea que la resistencia de las bacterias a los
antibióticos puede tener dos orígenes, uno
genético y otro no genético. El no genético
está relacionado con la aparición de resistencia
debido a la pérdida del blanco de acción de una
droga
específica en la bacteria o por un proceso de
inactivación (no multiplicación) que sufren algunas
especies en determinados tejidos que
infectan. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis
tiene la capacidad de sobrevivir en los tejidos durante
años sin multiplicarse después de causar un proceso
infeccioso tiempo durante el cual se hace resistente al
tratamiento. En cualquiera de estos casos la resistencia al
fármaco no se transfiere a otras generaciones celulares y
la susceptibilidad se recupera tan pronto el microorganismo
comience nuevamente a multiplicarse o recupere la estructura
perdida.

El mecanismo de resistencia genético, por su
carácter heredable y transmisible horizontalmente incluso
entre diferentes poblaciones microbianas, es el más
importante y es el que desarrolla la bacteria como respuesta al
ataque del agente antimicrobiano. Puede ser:

• Cromosómico: cuando se produce una
  mutación en un locus que controla dentro del genoma la
  susceptibilidad a un medicamento dado.

• Extracromosómico: cuando en el intervienen
  elementos no cromosomales conocidos como plásmidos los
  que pueden ser íntegramente transmitidos de una
  bacteria a otra por los diferentes procesos de intercambio
  genético (conjugación, transducción y
  transformación). De este modo la adquisición de
  uno solo de estos plásmidos R (plásmidos de
  resistencia) codifica en la bacteria resistencia para tantos
  antibióticos como información contenida tenga
  cada uno de ellos. Los transposones son pequeños
  segmentos de plásmidos R con capacidad de insertarse
  en cualquier sitio del genoma (mecanismo de
  transposición) que también codifican
  resistencia específica a diferentes
  fármacos.

Los mecanismos genéticos de resistencia a los
antimicrobianos más comunes son los siguientes:

• 1. Inactivación
  enzimática

• 2. Modificación estructural del blanco o
  sitio de acción

• 3. Disminución de la permeabilidad a la
  droga

• 4. Desarrollo de bombas de eflujo
  activo

Inactivación enzimática: Es el más
común. Las enzimas
más conocidas son las denominadas ÃY-lactamasas
desarrolladas por bacterias grampositivas y gramnegativas para
inactivar a los antibióticos del tipo
ÃY-lactámicos. La enzima es capaz de actuar sobre
el antibiótico antes de que éste se una a las PBP
que constituyen su blanco de acción Del mismo modo que son
estos los antibióticos más utilizados en la
clínica, en correspondencia con ello ya se han
identificado más de 300 enzimas ÃY-lactamasas, que
se diferencian en su perfil bioquímico y están
destinadas a la hidrólisis de diferentes
sustratos.

Modificaciones estructurales en los blancos o sitios de
acción: La bacteria desarrolla un blanco estructural
alterado incapaz de ser reconocido por el antibiótico
específico. Ej. las bacterias resistentes a la oxacilina
(penicilina capaz de resistir el efecto de las enzimas
ÃY-lactamasas) eluden el efecto del antibiótico
produciendo una modificación estructural de su blanco que
son las PBP.

Disminución de la permeabilidad a la droga: Ante
el ataque de determinados fármacos las bacterias pueden
evadirlo por modificaciones en la permeabilidad de la membrana al
medicamento. Por ejemplo, pérdida de poros de membrana
especializados en el transporte de
determinadas sustancias.

Desarrollo de bombas de eflujo
activo: Diferentes microorganismos han creado esta defensa ante
el ataque de un gran diversidad de fármacos. Producen
proteínas especializadas en extraer el antibiótico
del interior de la célula una
vez que ha penetrado en el espacio periplásmico. Este
mecanismo es extremadamente eficiente dado que la velocidad con
que la bacteria saca de su interior el antibiótico es
mayor que la velocidad con que éste penetra.

Resistencia cruzada: Cuando determinadas bacterias
presentan resistencia a varios antibióticos que comparten
parcial o totalmente un mismo mecanismo de acción, se dice
entonces que existe resistencia cruzada.

Pruebas de susceptibilidad a los
antimicrobianos.

Tan pronto como fue introducido en la práctica
clínica el uso de los antibióticos, surgió
también la necesidad de implementar métodos de
laboratorio capaces de medir el grado de efectividad de las
diferentes drogas empleadas en el tratamiento de un proceso
infeccioso específico.

La variedad de métodos y pruebas especiales
destinadas al estudio de la susceptibilidad y respaldo al
tratamiento antimicrobiano son muy variados y se han ido
perfeccionando a través del tiempo con el propósito
de hacerlos cada vez más eficientes y
efectivos.

Antibiograma: Es la prueba en la cual enfrentamos un
microorganismo a una concentración conocida de una droga
antimicrobiana para evaluar su efecto midiendo el crecimiento
microbiano a una temperatura y tiempo dados y comparándolo
con un estándar de referencia. Los métodos se basan
en la dilución o difusión del antibiótico en
medios específicos en los que se cultiva el microorganismo
y en todos los casos los resultados se interpretan a
través de las siguientes categorías de
susceptibilidad:

• Susceptible (S) Significa que el microorganismo
  causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente
  al tratamiento aplicado a las dosis habituales y por una
  vía apropiada.

• Medianamente Susceptible o Intermedio: (MS o I)
  Significa que el microorganismo solo se inhibirá por
  la droga si se aplica una dosis máxima y por una
  vía parenteral. (Salvo excepciones, estos medicamentos
  no deben ser seleccionados para el tratamiento, sobre todo
  aquellos en los que la dosis terapéutica está
  muy cercana a los rangos de toxicidad).

• Resistente: (R) Significa que el microorganismo no
  se inhibe por el antibiótico a las concentraciones
  sistémicas usualmente alcanzables por la droga cuando
  es aplicada por la vía y en las dosis
  adecuadas.

Métodos

• a) Macrodilución en caldo: Fue el
  primero que se desarrolló y constituye el
  método de referencia. Se realiza en tubos de ensayo
  conteniendo un medio de cultivo líquido (caldo Mueller
  Hinton) y en el que se realizan diluciones sucesivas de un
  antibiótico partiendo de una concentración
  conocida. Posteriormente se inocula cada tubo con igual
  cantidad de un inóculo estandarizado del
  microorganismo de prueba. Se incuba durante 18-24 horas
  tiempo al cual se realiza la lectura a simple vista buscando
  turbidez indicadora de crecimiento microbiano. Lectura: se
  identifica el tubo con la menor concentración del
  antibiótico a la cual no se obtuvo crecimiento
  microbiano visible (ausencia de turbidez) o lo que es lo
  mismo, la concentración mínima inhibidora (CMI)
  que se expresa en &µg/mL (Figura 1) y los
  resultados se comparan con los estándares de
  referencia específicos que han sido internacionalmente
  normados para diferentes microorganismos o grupos
  microbianos. El laboratorio informa el valor de la CMI
  determinada para cada antibiótico acompañado de
  la categoría de susceptibilidad correspondiente.
  Ventajas: método más exacto. Desventajas: gran
  complejidad de realización y costo elevado.

Fig.4.1: Test de
macrodilución en caldo. En los tubos donde hay menor
concentración del antibiótico (tubos de la
izquierda) aparece turbidez indicadora de crecimiento
bacteriano. Contando de derecha a izquierda, la
concentración de la droga contenida en el tubo ( 6 se
correspondería con la CMI para ese
antibiótico.

• b) Microdilución en caldo: El mismo
  método llevado a microtécnica. Tiene como
  ventajas que emplea menor cantidad de recursos y se facilita
  su ejecución Se realiza en placas de
  microtítulo de fondo plano con tapa, destinadas para
  estos fines. Diferentes métodos automatizados utilizan
  como base esta variante y se considera el método ideal
  para monitorear el tratamiento antimicrobiano en el paciente
  grave. La lectura, informe del laboratorio e
  interpretación de los resultados se realiza de igual
  forma a la antes descrita.

• c) Método de Bauer-Kirby: Es el
  internacionalmente recomendado para la práctica
  hospitalaria de rutina dada su sencillez y bajo costo, no
  obstante, está sujeto a múltiples errores
  técnicos razón por la que su realización
  requiere de un exhaustivo control de la calidad. Se realiza
  en placas de cultivo con Agar de Mueller-Hinton sobre las que
  se extiende el microorganismo de prueba con un hisopo de
  algodón estéril. Posteriormente sobre la
  superficie de la placa inoculada se colocan pequeños
  discos, comercialmente preparados, impregnados con
  concentraciones estandarizadas de los diferentes
  antibióticos y debidamente identificados. Las placas
  se incuban por un periodo de18-24 horas. Lectura: El
  antibiótico impregnado en el disco al hacer contacto
  con la superficie húmeda de la placa de agar
  difundirá en el medio impidiendo el crecimiento del
  microorganismo de prueba en correspondencia con su grado de
  susceptibilidad (halo de inhibición). Con una regla
  plana se mide en milímetros el halo obtenido en cada
  caso y se compara éste con los datos reflejados en las
  tablas de referencia para la interpretación de los
  resultados. Fig. 3 y 4. El Laboratorio informará el
  antibiótico acompañado de la categoría
  de susceptibilidad correspondiente.